Культура амаранта (Amaranthus) как источник амарантина : его функциональная роль,
биологическая активность и механизмы действия
Автор: доктор биологических наук Гинс Мурат Сабирович
Актуальность работы. Интродукция овощных растений с высоким содержанием белка, незаменимых аминокислот и биологически активных веществ (БАВ) актуальна во всем мире в связи с недостатком этих соединений в рационе питания населения многих стран, в том числе и в России.
Недостаток продуктов отечественного производства: пищевого белка, красителей и БАВ (пектин, соединения с Р-витаминной активностью, незаменимые аминокислоты, беталаины и др.) из растительного сырья пытаются восполнить импортом этих веществ в составе белковых концентратов, в основном из трансгенных растений сои, модифицированных продуктов, биологически активных добавок и синтетических красителей.
Особенно актуальна проблема окраски пищевых продуктов, где цвет вместе со вкусовыми свойствами, является одним из показателей качества пищевых изделий. В качестве пищевых красителей могут использоваться натуральные и синтетические красители. Основным недостатком синтетических красителей является токсичность (в большей или меньшей степени) не только самих пигментов, но и их составных компонентов -химических реагентов, присутствующих в красителе в виде примесей (Гордон, Грегори 1987г.; Смирнов, Береснева, 1991; Aldich,1991).
Материалом для получения натуральных красителей чаще всего является растительное сырье (Бокучава и др., 1976; Луцкая, Славуцкая, 1977; Рахимханов и др., 1983; Харламова, Кавка,1979).В настоящее время Госсанэпидемнадзором России разрешены к применению натуральные красители, вырабатываемые из каротиноидсодержащего (Е160, Е161) и антоциансодержащего растительного сырья (Е163), бетацианинсодержащей столовой свеклы (Е162). Натуральные красители не только безопасны для здоровья человека (при условии экологической чистоты используемого природного сырья), но и полезны как из-за биологической активности самих пигментов, так и за счет сопутствующих примесей: полифенолы, органические кислоты, витамины и др. биологически активные соединения.
Во всем мире современной тенденцией производства полноценных пищевых продуктов наибольшее значение отводится натуральным пищевым красителям, в связи, с чем необходим поиск новых источников воспроизводимого растительного сырья, обогащенного пигментами. Именно поэтому интродуцируемое растение амарант с высоким содержанием белка и природных красящих пигментов (бетацианинов, каротиноидов, флавоноидов, хлорофиллов и др.) все больше привлекает внимание ученых и промышленников.
Растение амарант относится к числу культур, которые отличаются высоким содержанием белка, большой продуктивностью биомассы, а также высокими адаптационными свойствами, приспособленные к произрастанию практически на всей территории России и которые характеризуются высокой эффективностью фотосинтетических процессов (Магомедов, 1995, 1997, 1999; Чиркова, 1995, 1997).
Пищевая ценность белка амаранта в сравнении с «идеальным» белком ФАО достаточно высока и составляет 75%. Повышенное содержание в листьях белка (до 20%) и веществ, обладающих биологической и антиокислительной активностью, а также микро-и макроэлементов, делают культуру амарант перспективным возобновляемым сырьем для использования в пищевой промышленности.
Острой проблемой современного общества является экологическая. Амарант служит эффективным фитомелиоратором, а экстракты из листьев и соцветий обладают антибактериальными, фунгицидными и нематицидными свойствами, что позволяет при использовании амаранта в земледелии сократить использование химических удобрений и пестицидов (Кононков и др. 1997; Войно, Гинс М., 2001; Удалова и др., 2003). В листьях амаранта содержится пектин и пищевые волокна, которые способны снижать накопление радионуклидов в организме и связывать тяжелые металлы. В условиях постоянного возрастания ухудшения экологической обстановки использование амаранта для получения веществ, обладающих защитным и иммунностимулирующим действием,обосновано. Выделение антиоксидантов из листьев амаранта, изучение их свойств и механизмов действия необходимо для понимания поиска закономерностей защиты растений от неспецифического окислительного стресса и приспособления их к новым условиям вегетации.
Следует отметить, что природные пигменты широко распространены в растительном мире. Большинство из них обладает биологической и витаминной активностью и являются необходимыми компонентами, как для растения, так и для человека. Предполагается, что одной из основных функций растительных пигментов является защита компонентов клетки от избытка световой энергии, УФ-радиации и других фотострессоров (Бриттон, 1986; Delgardo-Vargas at all.,2000). К настоящему времени подробно изучены функции и участие фотосинтетических пигментов, каротиноидов и антоцианов в защитно-приспособительных реакциях при стрессовых воздействиях (Запрометов, 1974, 1993; Удовенко, 1979, 1981,1995; Удовенко, Гончарова,1982,1989; Гудвин, Мерсер, 1986).
В растениях порядка Centrospermae распространены окрашенные алкалоиды - беталаины, которые разделяются на красно-фиолетовые пигменты - бетацианины и желтого цвета - бетаксантины (Piatelli, 1975, Mabry,1980, Гинс М.,2001, 2002).
Бетацианиновые пигменты обнаружены в красноокрашенных овощных растениях амаранта
(Amaranthus), киноа
(Chenopodium quinoa), а также столовой свеклы
(Beta vulgaris) и мангольда, которые способны накапливаться в различных органах растений. Красно-фиолетовый алкалоид бетацианин, выделенный из краснолистных видов амаранта, получил название амарантин, который является азотсодержащим гетероциклическим соединением. Его эмпирическая формула имеет вид C29H31N2O19, а молекулярная масса равна 711 Да. По своей природе бетацианиновые пигменты относятся к алкалоидам. Известно, что многие алкалоиды представляют собой физиологически активные соединения. Следует отметить, что, свойства и биологическая активность бетацианинов слабо изучены, в том числе и бетацианинового пигмента - амарантина из растений рода Amaranthus. Изучение физико-химических свойств и биологической активности амарантина в различных модельных системах необходимо для выяснения физиологических функций амарантина, которые он выполняет в растительной клетке.
Последовательность реакций синтеза молекулы амарантина из его предшественников - тирозина и фенилаланина подробно изучена с использованием меченых атомов углерода и азота (Гудвин, Мерсер,1986). Однако в литературе представлены неоднозначные данные по влиянию света на биосинтез пигмента. Особый интерес вызывают вопросы, касающиеся механизмов и путей регуляции синтеза амарантина и его накопления в листьях и стебле при действии света различного спектрального состава и интенсивности освещения.
Учитывая, что одним из центров происхождения амаранта являются высокогорные районы Латинской Америки, где растения подвергаются интенсивному УФ-облучению (Covas, 1996), актуальными являются исследования биологического действия длинноволнового УФ-А света в области 350-370 нм на содержание амарантина и фотосинтетических пигментов в листьях амаранта. Известно, что действие УФ- излучения и света высокой интенсивности усугубляется в присутствии фотосенсибилизаторов- веществ, которые повышают чувствительность растения и человека к свету, вызывая^ соответственно, фототоксические и фотоаллергические реакции. В связи с этим поиск природных соединений, которые способны защищать водорастворимые компоненты клетки от поражающего действия светового излучения^ и изучение механизмов их функционирования является актуальным и своевременным.
Одним из наиболее важных аспектов изучения биологической роли пигментов, в том числе и амарантина, является проблема защитно-приспособительной реакции растений амаранта к световому потоку, а также выявление механизмов протекторной функции амарантина по отношению к компонентам клетки при действии фотострессоров.
В мировой медицинской практике в настоящее время отмечается устойчивая тенденция увеличения использования,, наряду с лечебными, профилактических препаратов растительного происхождения. По прогнозам Всемирной организации здравоохранения в XXI веке только 20% химически чистых препаратов и лекарственных средств будет использоваться в практической медицине, тогда как более 80 % лекарственных средств будут использоваться в виде экстрактов и пищевых добавок, содержащих биологически активные вещества (БАВ).
В связи с этим разработка пищевых и биологически активных препаратов на основе воспроизводимого растительного сырья'из амаранта, обогащенного природным красно-фиолетовым пигментом - алкалоидом амарантином и другими БАВ и АО,является актуальным для профилактики здоровья человека. Актуштьность исследования в этом направлении вытекает и из правительственной «Концепции государственной политики в области здорового питания населения России на период до 2005 года». В соответствии с Концепцией в области производства пищевых продуктов необходимо создать технологии производства качественно новых пищевых продуктов с направленным изменением химического состава, соответствующего потребностям организма человека, и использовать воспроизводимое растительное сырье для производства полноценных продуктов питания.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является многоплановое изучение культуры амарант в связи с биосинтезом амарантина: определение физико-химических свойств, механизмов его функционирования, биологической активности и выяснение его роли при действии фотострессоров, а также разработка новых функциональных продуктов на основе сырья амаранта.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: изучить динамику роста, накопления биомассы и биосинтеза алкалоида амарантина у растений амаранта в онтогенезе и выявить взаимосвязь между фотосинтетической продуктивностью и накоплением алкалоида;
- изучить особенности роста и фотосинтеза у зелено- и краснолистных видов амаранта в связи с биосинтезом алкалоида амарантина;
- установить закономерности накопления амарантина в зависимости от биологических особенностей растений амаранта и экзогенных факторов;
- разработать способы выделения амарантина и изучить окислительно-восстановительные свойства и антиоксидантную активность амарантина в модельных системах in vitro и in vivo; оценить возможные механизмы его взаимодействия с активными формами кислорода; проанализировать сортовую взаимосвязь между накоплением амарантина и содержанием метаболитов в шикиматном пути хлоропластов в растениях амаранта при селекции на повышенное содержание амарантина; разработать новые технологии получения обогащенных и комбинированных продуктов питания функционального назначения.
Научная новизна исследования. Впервые показана ценность культуры амарант как источника биологически активных веществ, в том числе, алкалоида амарантина. Экспериментально обосновано, что одним из факторов аккумуляции амарантина в красноокрашенных видах амаранта является оптимизация световых и температурных условий выращивания, а также минерального питания, при которых усиливается биосинтез пигмента. При этом различные генотипы существенно различаются между собой по способности накапливать амарантин в темноте и на свету, что связано с возможностью альтернативных путей биосинтеза амарантина в нефотосинтезирующих тканях и хлоропластах. В серии экспериментов с набором сортов амаранта, подвергнутых воздействию факторов стрессового характера (дефицит и избыток освещения, УФ-А свет, пониженные температуры), показана неодинаковая изменчивость содержания амарантина в зависимости от вида растения и возраста листьев. Представленные в работе данные являются новой информацией для понимания путей регуляции содержания амарантина — в онтогенезе растения, а также при действии света различного спектрального состава и интенсивности освещения и минерального питания. Новыми являются данные о способности УФ-А света индуцировать биосинтез амарантина в семядольных листьях этиолированных проростков амаранта.
Впервые в различных модельных системах in vitro изучена антиоксидантная активность амарантина и выявлены механизмы' его антиокислительного действия. Совокупность результатов, полученных в итоге многоплановых экспериментальных исследований^, позволили выдвинуть новые представления о механизмах антиокислительного действия амарантина путем ингибирования супероксид анион-радикала и свободных радикалов, образующихся при окислительном стрессе, инициированном облучением УФ-А светом и светом высокой интенсивности, а также образования активных комплексов с ионами металлов переменной валентности, которые катализируют и регулируют свободно-радикальные реакции.
В модельной системе с изолированными хлоропластами впервые обнаружена способность амарантина восстанавливаться при взаимодействии с компонентами электрон-транспортной цепи на акцепторном участке фотосистемы II (ФСН), расположенными до пластохинона. Выявлено неоднозначное влияние различных концентраций амарантина на показатели медленной индукции флуоресценции и термолюминисценции, что свидетельствует о различной эффективности функционирования ФСН в присутствии амарантина. Показано, что амарантин влияет на перенос электронов на участке фотосистемы I (ФС1), частично восстанавливая реакционные центры ФС1.
Из листьев амаранта выделены три формы амарантина: низкомолекулярная и две высокомолекулярные, одна из которых связана с белком, а другая с пектином, изучен их биохимический состав. Впервые выявлен характер общих закономерностей между накоплением амарантина и изменением содержания флавоноидов, лигнина, ауксинов, синтезирующихся по шикиматному пути в хлоропластах, а также белка и клетчатки в листьях амаранта сорта Валентина.
Новизна разработанных способов получения амарантина подтверждена тремя патентами на изобретения (№ 2118971, № 2140432 и № 2214710), а создание салатного сорта амаранта Валентина подтверждено авторским свидетельством Российской Федерации № 31748, который внесен в Госреестр селекционных достижений России, допущенных к использованию в сельском хозяйстве и перерабатывающей промышленности.
Научно-практическая значимость работы. Полученные результаты имеют прежде всего теоретическое значение, расширяя знания о восстановительных и антиоксидантных свойствах, биологической активности и функциональной роли алкалоида амарантина, а также углубляя представления о возможности регуляции содержания амарантина светом в листьях проростков и взрослых растений амаранта.
Впервые разработана методология биохимической селекции с использованием биохимических показателей для создания сортов овощных культур с повышенным содержанием биологически активных веществ. Использование семейственного отбора растений амаранта на повышенное содержание амарантина позволило создать сорт Валентина с высоким содержанием амарантина, флавоноидов, пектина с целью использования его в пищевой промышленности в качестве технической культуры для получения функциональных продуктов нового поколения.
Разработанный способ получения амарантина из листьев краснолистного сорта Валентина и выявленные закономерности накопления пигмента амарантина в онтогенезе растения могут найти применение в промышленной биотехнологии для получения натурального растительного пищевого красителя, экономически более эффективного по сравнению со свекольным.
Разработаны и утверждены в установленном порядке технические условия (ТУ) и технологическая инструкция на производство пищевого красителя "Амфикра" (ТУ 9169-001-31890466-97), пищевой приправы "Амвита" (ТУ 9161-001-45727225-01), новые продукты чая (ТУ 9191-43104605473-01): чай черный байховый с листьями амаранта (60% чая и 40% листьев амаранта) и чай зелённый с листьями амаранта (80% чая и 20% листьев амаранта) сорта Валентина. На основании проведенных исследований на научную документацию получены удостоверения МЗ РФ о возможности производства вышеуказанных функциональных продуктов и приправ на пищевые цели, которые по сравнению с традиционными продуктами обеспечивают:
-повышение питательных (высокое содержание белка, липидов), и антистрессовых (большой набор антиоксидантов) свойств;
-экологическую безопасность (отсутствие токсических веществ, болезнетворных микроорганизмов, высокое содержание пектинов, способных связывать ионы тяжелых металлов и выводить их из организма).
Народнохозяйственная значимость выполненной работы состоит в том, что широкое внедрение амаранта в сельскохозяйственное производство и создание на его базе высокобелково — витаминного сорта Валентина обеспечивает пищевую промышленность ценным растительным сырьём, увеличивает производство, расширяя ассортимент лечебно-профилактических продуктов с повышенным содержанием БАВ, АО и микронутриентов, а также имеет определенное социальное значение в решении проблемы здоровья нации.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту: онтогенетические особенности фотосинтеза, роста и развития растений красноокрашенных видов амаранта в связи с биосинтезом алкалоида амарантина;
- физико-химические и антиоксидантные свойства амарантина как основа, определяющая физиолого-биохимические функции (протекторную, резервирование азота, переносчика электронов) и биологическую активность пигмента (эффекты стимуляции прорастания семян, реакций фотосинтеза, активность ферментов, роста и развития растений, нарастания биомассы бифидобактерий);
- системный подход к формированию пула амарантина у растений амаранта с учетом их биологических особенностей, воздействия света различной интенсивности и спектрального состава и оптимизированных элементов (азот, фосфор, калий); эффективность селекции амаранта по содержанию амарантина как результат изменения содержания и соотношения основных продуктов биосинтеза клетки: белков, пектина, флавоноидов, аминокислот; новые технологические процессы получения нового поколения обогащенных и комбинированных продуктов функционального назначения (Амфикра, Амвита, чай черный с амарантом, чай зеленый с амарантом) и биохимическая оценка их качества.
| [b]ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ[/b]
1. Показана значимость культуры амарант для пищевой промышленности и как источника красноокрашенного алкалоида амарантина, биосинтез которого является одной из защитно-приспособительных реакций растения к абиотическим и биотическим факторам среды.
2. Обнаружено новое антиоксидантное свойство алкалоида амарантина и изучены биохимические механизмы его действия: ингибирование супероксид анион радикала и свободных радикалов; образование комплекса с ионами переходных металлов (железо, медь, цинк), которые катализируют образование свободных радикалов.
3. Впервые в модельной системе с изолированными хлоропластами экспериментально установлено, что амарантин взаимодействует с электрон-транспортной цепью хлоропластов на акцепторном участке фотосистемы И, расположенном до места действия DCMU, восстанавливаясь до свободно-радикального состояния (Am—» Am").
4. Показано, что в модельной системе с изолированными-хлоропластами из листьев амаранта разного возраста скорость переноса электронов по псевдоциклическому пути усиливается с увеличением возраста листа и достигает максимального значения в полностью сформированной листовой пластине, при старении листа транспорт электронов на молекулярный кислород снижается; скорость псевдоциклического транспорта переноса электронов выше в хлоропластах, выделенных из листьев красноокрашенных видов, по сравнению с зеленоокрашенными.
5. Установлено существование двух путей синтеза амарантина: темнового (в нефотосинтезирующих тканях) и светового (в фотосинтезирующих тканях), при этом способность амаранта накапливать пигмент в этиолированных и световых проростках обусловлена генотипом: источниками наибольшего содержания алкалоида являются видообразцы
[i]A. tricolor[/i] (к-99), [i]A. cruentus[/i] (к-23), [i]A. gangeticus[/i] (к-103), [i]A. caudatus[/i] (к-124) и сорт Валентина.
6. Впервые обнаружено, что в листьях амарантин присутствует в 3-х формах - свободной (извлекается водой или разбавленными спиртовыми растворами), связанной с белком и связанной с пектином; содержание этих форм (% от содержания сухого вещества) в листьях растений сорта Валентина следующее: 1,7 -свободная форма, 2,7 -связанная с белком и 0,7 -связанная с пектином.
7. Впервые установлено, что усиление биосинтеза амарантина в листьях растений амаранта сорта Валентина приводит к уменьшению содержания в них лигнина, клетчатки, белка (по сравнению с родительской формой к-99), а также к изменению морфологических признаков -увеличению интенсивности окраски и уменьшению удельной плотности листа.
8. Обнаружена способность УФ-А света индуцировать синтез амарантина в клетках эпидермиса семядольных листьев проростков и выявлена динамика накопления алкалоида при длительном действии УФ-А света (до 5 час) в следующей последовательности: клетки нижнего эпидермиса, клетки верхнего эпидермиса и клетки мезофилла.
9. Установлена зависимость накопления азотсодержащего алкалоида амарантина от дозы азота в почве. Показано усиление аккумуляции азотсодержащего алкалоида амарантина в листьях амаранта при повышении дозы азота в почве, интенсивности освещения и с уменьшением возраста листа.
10. Показано стимулирующее и ингибирующее влияние амарантина на энергию прорастания и всхожесть семян, на прирост биомассы проростков и вегетирующих овощных растений (дайкон, перец, хризантема съедобная, китайская капуста и др.). При этом для каждого вида растения характерна оптимальная стимулирующая концентрация.
11. Разработаны технологии производства получения нового поколения продуктов питания разного функционального назначения -пищевой добавки Амвита, натурального пищевого красителя Амфикра, обогащенных биологически активными веществами и антиоксидантами, оформлена соответствующая научно-техническая документация и получены санитарно-гигиенические заключения Минздрава РФ.
12. Разработаны технологии получения нового поколения продуктов чая на основе амаранта. Использование нетрадиционного растительного сырья (листьев амаранта) в сочетании с черным и зеленым байховым чаем позволило обогатить чайный продукт соединениями, обладающими Р-витаминной активностью: флавоноидами -3,1 %, при этом повысив содержание кверцитина и рутина в 3 раза, а также белком, пектином, аминокислотами, в том числе незаменимыми аминокислотами, кальцием, железом, органогенным кремнием, что является принципиально новым по сравнению с традиционными чаями. | [b]ЗАКЛЮЧЕНИЕ[/b]
Основная задача, которой посвящена предлагаемая работа, состоит в выяснении вопроса: какова роль эндогенных и экзогенных факторов в регуляции биосинтеза амарантина и в связи с этим: каковы функции алкалоида амарантина, который способен накапливаться в большом количестве в красноокрашенных видообразцах амаранта. Вопрос этот является стержнем, который логично связывает свойства молекулы амарантина и определяемую ими биологическую активность алкалоида в различных модельных системах in vitro и при обработке растений, микроорганизмов и фитопаразитов.
Биологической особенностью амаранта на начальном этапе развития является быстрый рост корней и стебля и лимитирование нарастания биомассы листьев у проростков зелено- и краснолистных видов амаранта, которое обусловлено низким фотосинтетическим потенциалом первых двух пар настоящих листьев, недостаточным для обеспечения высокой скорости прироста фотосинтезирующей площади этих листьев. Следующей особенностью вегетирующих растений амаранта является накопление большого количества амарантина в листьях интенсивно окрашенных видов и формирование меньшего габитуса растений по сравнению с зеленными формами.
Представленные в работе результаты свидетельствуют, что красно-фиолетовый алкалоид амарантин способен выполнять в клетке разнообразные функции. С одной стороны, амарантин в качестве детоксикатора активных форм кислорода и свободных радикалов участвует в защитной системе клетки в условиях неспецифического окислительного стресса, с другой стороны, являясь алкалоидом, ведет себя подобно физиологически активным веществам, стимулирует процессы фотосинтеза, роста и развития растений или ингибирует их в зависимости от концентрации. Полифункциональность свойств амарантина можно объяснить структурой его молекулы, в состав которой входят высоко реакционные гетероциклы (дегидроиндольное и дегидропиридиновое кольца) и два атома азота.
Окислительно-восстановительные и антиоксидантные свойства молекул амарантина, а также его способность образовывать комплексы с ионами переменных металлов и взаимодействовать с фотосенсибилизаторами лежат в основе механизмов его протекторной функции. Динамика содержания амарантина в листьях амаранта имеет приспособительный характер к световому освещению и температуре и одной из его функций является защита компонентов клетки от активных форм кислорода, в частности, супероксид анион радикала и свободных радикалов, образующихся в ней при действии УФ-А - радиации, высокой интенсивности света и пониженных температур.
Помимо протекторной функции, амарантин активно участвует в метаболических реакциях азотистого обмена растения. Амарантин является конечной формой в реакциях превращения азотистых соединений в растениях амаранта; в этой форме азотистые продукты обмена веществ обезвреживаются и сохраняются. Накопление амарантина в большом количестве в листьях красноокрашенных видов обусловлено спецификой аминокислотного обмена в клетке. Так в листьях интенсивно-окрашенных видов амаранта содержание тирозина и фенилаланина, предшественников амарантина составляет до 40-50% от суммы свободных аминокислот.
Алкалоид амарантин — азотистое гетероциклическое соединение, оказывающее весьма значительное физиологическое действие на организм. В физиологических дозах амарантин оказывает стимулирующее, а в больших -угнетающее действие на прорастание семян, рост и развитие растений, цветение, развитие корневой системы, рост микроорганизмов, а также нематоцидную активность
Широкий спектр биологического действия амарантина на рост и развитие растений может быть связан со способностью амарантина взаимодействовать с компонентами электрон-транспортной цепи фотосинтеза, стимулируя образование восстановленных пиридин-нуклеотидов и АТФ, которые используются на различные синтетические и метаболические процессы в клетке. |
Ваш Жак Паганель 
